PRÁCTICA 5. TINCIONES NEGATIVAS Y DIFERENCIALES.

 PRÁCTICA 5. TINCIONES NEGATIVAS Y DIFERENCIALES.

FUNDAMENTO

Tinciones diferenciales: La mayoría de tinciones diferenciales incluyen tres pasos: 

1. Aplicación de un colorante primario, que es incorporado por todas las células o todos los orgánulos por igual. 

2. Decoloración diferencial que elimina el colorante de unos tipos celulares/orgánulos/partes de la célula, pero no de otros. 

3. Aplicación de un colorante de contraste que teñirá únicamente aquellas células/orgánulos que hubieran sufrido decoloración en el segundo paso, permitiendo visualizarlos en otro color. 

El paso crítico de estas tinciones es la decoloración, que debe hacerse con sumo cuidado para que el proceso de lugar a una correcta visualización y diferenciación. 

- Tinción diferencial de Gram: La tinción de Gram fue desarrollada empíricamente a finales del siglo XIX para poner de manifiesto la presencia de bacterias en preparaciones de tejidos infectados. Pronto se averiguó que las bacterias manifestaban dos comportamientos distintos frente a esta tinción. Algunas eran capaces de retener el complejo cristal violeta-ioduro después de ser decoloradas con etanol o acetona mientras que otras bacterias no eran capaces de retener el complejo colorante y se decoloraban. 

A las primeras se las denominó Grampositivas y a las segundas, Gramnegativas. No fue hasta mucho tiempo después cuando se conoció que el diferente comportamiento de los dos tipos de bacterias respondía a una muy diferente arquitectura y composición química de sus paredes celulares.

- Tinción diferencial de Ziehl-Neelsen: La tinción de Ziehl-Neelsen, es una técnica de tinción diferencial que permite la identificación de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR). Entre los BAAR se encuentran las micobacterias, agentes etiológicos de enfermedades como la tuberculosis (TBC) y la lepra. 

Es un método de tinción que permite un diagnóstico rápido y presuntivo de la infección tuberculosa por micobacterias. Debemos el nombre de esta tinción al bacteriólogo Franz Ziehl y al patólogo Friedrich Neelsen, quienes la desarrollaron el año 1883.

En este caso, la tinción diferencial, permite distinguir un grupo especial de bacterias, cuya pared presenta resistencia a la decoloración por una mezcla de ácido-alcohol (BAAR+). Se realiza la tinción en caliente con un colorante básico (fucsina fenicada), con el que todas las bacterias se tiñen, seguida de una decoloración en frío con una mezcla ácido-alcohol, que decolorará las bacterias AAR-. Luego, éstas se tiñen con un colorante de contraste (azul de metileno). Las BAAR+ se tiñen de fucsia (o rojo) y las BAAR-, de azul, por lo que se determina que Mycobacterium phlei (bacilos), son bacterias ácido-alcohol resistentes (positivas), mientras que las Micrococcus luteus (cocos), no lo son.

PROCEDIMIENTO

Tinción diferencial de Gram

1. Siguiendo los procedimientos asépticos, realizar una mezcla de dos cultivos bacterianos en un portaobjetos limpio y desengrasado con alcohol. Recordar siempre que la suspensión ha de ser ligera para que luego se puedan distinguir las células individuales.

2. Mezclar en la gota de agua un cultivo de bacterias Gram + y otra de Gram -.

3. Realizar una extensión o frotis.

4. Secar al aire.

5. Fijar la preparación por calor. 

6. Dejar enfriar el porta situado en las paralelas. 

7. Cubrir toda la preparación con cristal violeta durante 1 minuto. 

8. Lavar con agua. 

9. Añadir lugol (mordiente, que fija el color) y mantener durante 2 minutos. 

10.Lavar con agua. 

11.Decolorar la preparación con etanol 96º durante 30 segundos. Es importante lavar inmediatamente con agua tras los 30 segundos totales de decoloración. 

12.Lavar con agua. 

13.Aplicar fucsina básica (o safranina) a la preparación durante 2 minutos. 

14.Lavar con agua. 

15.Secar al aire. 

16.Observar al microscopio con el objetivo de inmersión. 

Tinción diferencial de Ziehl-Neelsen

1. Siguiendo los procedimientos asépticos, realizar una mezcla de dos cultivos bacterianos en un portaobjetos limpio y desengrasado con alcohol. Recordar siempre que la suspensión ha de ser ligera para que luego se puedan distinguir las células individuales. 

2. Resuspender en una gota de inóculo de Mycobacterium phlei (BAAR+), una gota del inóculo de Micrococcus luteus (BAAR-). 

3. Realizar una extensión o frotis. 

4. Secar al aire. 

5. Fijar la preparación por calor. 

6. Dejar enfriar el portaobjetos situado en las paralelas. 

7. Cubrir toda la preparación con fucsina fenicada de Ziehl durante 5 minutos a emisión de vapores, es decir, forzar la tinción calentando con el mechero (también puede hacerse una especie de antorcha, colocando algodón en la punta del asa, impregnarla de alcohol y prenderle fuego), cuidando de que la preparación NO se deseque y NO hierva. Dicho calor actúa como mordiente. 

8. Lavar con agua. 

9. Decolorar la preparación con alcohol-clorhídrico (97% etanol 96º y 3% HCl), durante 30 segundos. 10.Lavar con agua. Es importante lavar inmediatamente con agua tras los 30 segundos totales de decoloración. 

11.Cubrir la extensión con Azul de Metileno durante 5 minutos. 

12.Lavar con agua. 

13.Secar al aire. 

14.Observar al microscopio con el objetivo de inmersión

RESULTADOS

Las bacterias Grampositivas se verán de color violeta oscuro, mientras que las Gramnegativas, que han perdido el primer colorante, se verán rosa por efecto de la fucsina (o rojas por efecto de la safranina).

Las bacterias ácido-alcohol resistentes se verán de color rosa por efecto de la fucsina y las restantes en azul.

Tinción diferencial de Ziehl-Neelsen

Tinción diferencial de Ziehl-Neelsen

Tinción diferencial de Gram

OBSERVACIONES

Es importante coger una cantidad adecuada de muestra para facilitar la visualización.

Se debe tener en cuenta los tiempos del colorante, sobre todo con el alcohol, ya que si nos pasamos de tiempo, se decolorarán todas las bacterias y no las podremos diferenciar.

Todas las tinciones de bacterias se observarán con microscopios ópticos de campo claro y con objetivo de inmersión (100x), lo que implica, además del uso de aceite de inmersión aplicado directamente a la preparación, un cuidado especial en el proceso de enfoque del microscopio, con el fin de no forzar ni dañar los objetivos del mismo. Los microscopios se guardarán en los armarios tras su uso, después de limpiar cuidadosamente los restos de aceite de inmersión de los objetivos y se cubrirán con sus fundas hasta la próxima utilización.

 

Observaciones